填料问题

1、问：葡聚糖凝胶 G-10、G-15、 G-25 、G-50、 G-75、 G-100、 G-150 、G-200说明书。

答：这几个填料的说明书是通用的，直接搜索葡聚糖凝胶

2、问：填料保质期

   答：标签上都有标注，可以要一下标签，货让客户以标签上的信息为主。预溶胀的填料，保质期较长，一般保存在20%乙醇中。干粉状的填料保质期较短。

3、问：填料保存方法

答：未使用时以标签上的保存方法为主，溶胀后，按照说明书上的保存方法为主。一般溶胀使用后，冲洗干净，放在20%乙醇中保存，保存过程中注意不能结冰，经常观察换液，避免填料长菌。当液体较少时及时添加20%乙醇，填料溶胀后就不能让填料变干了，须一直在液体中浸泡。

4、问：葡聚糖凝胶预处理

   答：建议过夜浸泡，不建议煮沸，长时间煮沸填料，会破坏填料的结构。

5、问：D8900  DEAE-32和C8930  DEAE-52的区别是什么？

   答：这两种填料都是弱的阴离子交换柱，DEAE-32是干粉，DEAE-52是预溶胀的填料，保存在20%乙醇中。

6、问：层析柱的选择

  答:我们的层析柱包括亲和层析柱、普通层析柱、中压玻璃层析柱，亲和层析柱一般体积比较小，两端带筛板 50um。普通层析柱和中压玻璃层析柱有不同规格的，可加压。客户可根据自己装柱的高度和所需的直径进行选择。

7、问：有没有预装柱

   答：有，可定制

8、问:平衡缓冲液和洗脱缓冲液是什么？

答：一般离子填料，平衡缓冲液和蛋白样品缓冲液有相同的PH值和离子浓度，便于目的蛋白挂柱。洗脱缓冲液的离子浓度一般高于平衡缓冲液的离子浓度，或者进行梯度洗脱，便于将蛋白洗脱下来。

9、问：样品有颜色怎么办？

答：样品过柱前建议都先过一下0.45um的滤器，一是去除样品中的杂质，防止，样品过柱时堵住填料的孔径。二是，去除色素，如果有色素吸附到填料上，是洗脱不下来的，会影响填料的分离效果。

10、问：装柱过程中怎么避免气泡产生？

答：温度不一致的情况下容易产生气泡，要注意使用的器皿，填料以及缓冲液是一致的温度，最好是与室温一致，填料装柱的时候用玻璃棒引流，不要产生气泡，这样会有效的避免气泡的产生。

11、问：怎么确定填料够不够用，应该选择什么规格的填料？

  答：对于离子型填料，都会有一个载量的问题，或者标签蛋白纯化的填料，这种填料的选择，一般是根据客户的蛋白量以及样品体积进行确定的。对于起分子筛作用的填料，规格选择，一般是根据客户的样本量和客户想要装的填料的体积来选择。

12、问：填料什么情况下进行在位清洗或者再生？

答：如果每次都是纯化的同一种蛋白，没必要每次洗脱后都进行在位清洗，一般是用几次后进行一次在未清洗，当感觉填料载量下降，颜色有变化，流速下降的情况下可以做一下再生，再生的时候用到过氧化氢的浓度不建议超过0.15M,长时间用高浓度的氢氧化钠清洗，会意向填料的稳定性，很有可能会将填料的配基洗掉。说明书上提到的用0.5M的氢氧化钠处理，指的是暂时性的，并不能长期使用。

13、问：亲和层析柱大小，筛板孔径？

   答：以 DS0110亲和层析柱12ml (1.5*8)为例，12ml指的是这个柱子的柱体积，1.5指的亲和层析柱的内径是1.5cm,8指的是柱子的高度是8cm。亲和层析柱含1个空管柱，上下盖和2个筛板（亲水性，筛板孔径50um）。

14、问：凝胶过滤如何选择填料？

    答：（1）葡聚糖凝胶：Sephadex（Sephadex G中的G值越小，交联度越大，吸水性越小）适合脱盐、buffer交换。

（2）琼脂糖凝胶：Sepharose（宽广的分离范围）

琼脂糖及葡萄糖组成的复合凝胶：Superdex，一般称为琼葡糖凝胶（高分辨率、高回收率、运行时间短）。

15、问：凝胶过滤填料的选择原则

   答：（1）凝胶的交联度越高，孔径越小。

（2）对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。

（3）对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。

（4）凝胶颗粒的粗细影响分离效果，我们公司主要是中颗粒的产品。

16、 问：葡聚糖凝胶系列保质期，分离范围，最大耐压等信息

葡聚糖凝胶Sephadex是用环氧氯丙烷为交联剂，在碱性条件下交联而成商品化凝胶。亲水性强，在水中吸水迅速膨胀。在碱、弱酸中稳定，可高压灭菌。葡聚糖凝胶G系列产品，交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质

Sephadex 根据颗粒大小可以分为四种：粗（C:Coarse）、中（M:Medium）、细（F:Fine）、超细（SF:Superfine)。一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒反压大， 流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex 的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。

LH构型葡聚糖凝胶：Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基(羧基)基团，形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。

17、问：琼脂糖凝胶2B、4B、6B、4FF、HP分别代表什么意思？

答：4B或者6B 代表的是琼脂糖凝胶中交联琼脂糖的含量，交联度越大孔径越小，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，而吸附容量比Sepharose 2B大，所以Sepharose 4B应用最广。FF指的是Fast Flow， FF系列可以耐受较高的流速，轻松实现规模扩大的分离纯化，在短时间内得到较好的分辨率。HP指的是High Performance，HP系列有更高的分辨率。

18、问:蛋白纯化，填料选择指南

  答：生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、生化分子等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。

《测定――分子量、PI》

■当目标蛋白的物理特性如分子量、PI 等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广的填料很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同pH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳pH。

《选择――层析方法》

■若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：

（一）使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质依据分子量将样品分成不同组份。

（二）用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。

（三）体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。

《纯化――大量粗品》

■处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用大粒径、高流速的离子交换介质。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。

《纯化――硫酸氨样品》

■硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用SephadexG-25脱盐。疏水层析是较新的技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。

《纯化――糖类分子》

■固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。

■一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD 以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏反应的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。

《纯化――糖蛋白》

■偶联凝集素的琼脂糖凝胶FF可以分离各种糖蛋白，例如Con A 琼脂糖凝胶 FF可以纯化糖基化的蛋白，或者膜组分，甚至细胞等物质。此外硼酸琼脂糖凝胶FF也用来分离各种多糖和糖蛋白，其原理是苯硼酸类似于凝集素可以和各种糖基上的邻二羟基发生亲和作用，通过降低pH或者竞争洗脱的方法就可以纯化各种糖和糖蛋白。

《纯化――膜蛋白》

■膜蛋白相对有比较强的疏水性，可以用苯基或丁基填料做疏水色谱分离，如果是有糖基结构或者受体等，也可以用亲和色谱的方法。没有现成的亲和填料可以用活化好的填料去合成，还可以结合离子交换和凝胶过滤等色谱手段进一步纯化。

■膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，以此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。

《纯化――单抗、抗原》

■单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同来源的IgG（见附录）。重组Protein A对IgG有较高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A 用离子交换Q Sepharose HP凝胶即可很容易去除。

■血清互补剂如小牛血清可先用Protein G预处理，在培养前除去IgG。

■疏水层析苯基-琼脂糖凝胶HP亦很适合纯化IgG。可有效去除抗体中的聚集体。

■纯化IgG 抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHS activated 琼脂糖凝胶偶联IgG,再进一步获取IgG 抗原。

■吡啶琼脂糖凝胶 FF适用于 IgY、IgM、超螺旋 DNA 等的分离纯化。

《纯化――重组蛋白》

■重组蛋白在设计和构建的时候应该已经考虑到了纯化的问题。在此，我们提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。

一、HIS标签重组蛋白可以很方便用镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF分离，填料已经螯合好了镍离子，使用非常方便，有更高的吸附载量，特异性更强，可以选择多种洗脱方式，是纯化这类融合蛋白的最佳工具，也可以选择HP级别高分辨率的填料。

二、GST融合蛋白在表达时同时表达了谷胱甘肽-S-转酶，很方便用GST琼脂糖凝胶FF分离，然后再用肠激酶或凝血酶等酶解就得到表达的产物。凝血酶可以用肝素琼脂糖凝胶FF或苯甲脒琼脂糖凝胶FF分离。

三、Protein A融合载体使要表达的蛋白和Protein A 的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6FF 纯化。

《纯化――血浆蛋白》

■阴离子交换在血浆蛋白的纯化中应用非常广泛，结合低温乙醇法在丙种球蛋白纯化后期用DEAE-琼脂糖凝胶FF吸附二聚体等杂质从而达到提高产品纯度的目的，同样也可以在白蛋白纯化过程中使用阴离子交换吸附PKA、微量的IgG以及聚体，在凝血VIII因子纯化过程中使用大孔径的Q琼脂糖凝胶可以增加载量和回收率。使用传统的DEAE sephardex A-50纯化凝血酶原复合物(PCC)也是非常经典的方法。

《纯化――包涵体蛋白》

■包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Sepharose 6FF 凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Q Sepharose FF 和Phenyl Sepharose FF 分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。

《包涵体蛋白固相复性》

■近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定(吸附)在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。

■固相复性方法也被用于以镍琼脂糖凝胶直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以肝素琼脂糖凝胶直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。

《纯化――肽类》

■肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析或离子交换树脂作纯化。

《纯化――核酸、病毒》

■核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF或 Sepharose 4FF 凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换 Q琼脂糖凝胶分离核酸。也可以用DEAE或Q琼脂糖凝胶FF富集和分离后再上琼脂糖凝胶6B FF得到纯的病毒

《疫苗纯化--病毒类疫苗纯化》

■凝胶过滤介质 Sepharose 4 Fast Flow 或Sepharose 6 Fast Flow是经典的病毒类疫苗纯化方法，可以去除培养基中的杂蛋白、处理量大、快速的特点。柱高一般40-70cm，上样量一般为10-15%。目前使用此方法生产的疫苗品种有： 乙肝、狂犬、出血热、流感等，分子量较小的疫苗也可以 Sephacryl S-500 HR，如甲肝疫苗。

《纯化――中草药有效成分》

■中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成分多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。葡聚糖凝胶LH-20同时具备吸附性层析和分子筛功能，例如：用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。葡聚糖凝胶LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。

■生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，SP 阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在Q 阴离子交换柱上分离效果良好。

《抗生素聚合物分析》

■中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规定使用葡聚糖凝胶G10过滤法测定。

《去除――蛋白中的核酸》

■大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如SP 或CM Sepharose FF结合目标蛋白，可除去大量核酸。核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的同时去除核酸。利用核酸酶将核酸切成小片断，用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。

《去除――病毒和微生物》

■病毒和微生物可成为病原，应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。

■病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D (solvent/detergent)处理，使病毒失活，如Triton和Tween。再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF 结合目标蛋白，去除S/D。

《去除――血清白蛋白》

■蓝色琼脂糖凝胶FF可以用于分离各种激酶或依赖核苷酸为辅酶的酶，它特异性和白蛋白结合，所以用它去除样品中的血清蛋白的干扰，使样品更好纯化。PH4.5左右 l ml 填料可以去除0.3 ml 血浆中的白蛋白，载量为15mg/ml。用镍琼脂糖凝胶FF也可以和白蛋白结合，载量为5-20mg/ml。

《脱盐、小分子去除》

■使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分种至半小时完成。Sephadex G25 系列介质专为蛋白质脱盐而设计。

■病毒、DNA疫苗或质粒可以用琼脂糖凝胶6B/FF除盐或交换缓冲液，蛋白、抗体等可以用琼葡糖凝胶G15/FF或葡聚糖凝胶G25快速去盐和交换缓冲液，前者适合分子量大于3000以上物质的，应用范围比普通的sephadex G25更广。

19、问：强阴离子交换层析介质（QAE ,Q）

答：  S8851   Q-琼脂糖凝胶FF

S9200  Q-琼脂糖凝胶HP

S9820  QAE-葡聚糖凝胶A-25

S9830   QAE-葡聚糖凝胶A-50

20、问：强阳离子交换层析介质（SP,S）

答：  S8861   SP-琼脂糖凝胶 FF

S9220   SP -琼脂糖凝胶 H.P.

S9800   SP-葡聚糖凝胶C-25

S9810   SP-葡聚糖凝胶C-50

21、问：弱阴离子交换层析介质（DEAE）

答： S8800   DEAE-琼脂糖凝胶FF GE分装

S8801   DEAE-琼脂糖凝胶FF

S8791   DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B

D8300   DEAE葡聚糖凝胶A-25

S9130   DEAE葡聚糖凝胶A-50

      D8900    DEAE-纤维素 DE-32

C8930     DEAE纤维素 DE-52

C8350    DEAE纤维素DE-52（进口）

22、问：弱阳离子交换层析介质（CM）

答：  S8781    CM-琼脂糖凝胶FF

S9230    CM-琼脂糖凝胶CL-6B

S8240    CM Sephadex C-25 CM-葡聚糖凝胶C-25

S8180    CM-葡聚糖凝胶C-50

C8691    羧甲基纤维素CM-52

23、问：凝胶过滤层析的介质分类有哪些？

答：葡聚糖凝胶：Sephadex（Sephadex G中的G值越小，交联度越大，吸水性越小）适合脱盐、buffer交换。

琼脂糖凝胶：Sepharose（宽广的分离范围）

琼葡糖凝胶：Superdex琼脂糖及葡萄糖组成的复合凝胶，高分辨率、高回收率、运行时间短

聚酰胺凝胶：目数越高，分离效果越好，分离的物质种类越多，但是分离的条件越不好摸索，分离还要结合洗脱液体系和分离体系的复杂程度来选择，一般粗分用60-100目，细分用200-300目的。

24、问:琼脂糖凝胶系列产品

答：琼脂糖是由D-半乳糖和3，6位脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，在温度100℃时呈液态，当下降至45℃以下时，通过分子间氢键，自发凝集成束，形成珠状凝胶。稳定性差。它们之间相互连接成线性双链单环的琼脂糖；再凝聚即呈琼脂糖凝胶。

琼脂糖凝胶在干燥状态下保存易破裂，故一般均存放在含防腐剂的溶液中。40度以上易老化。不能高压和冰冻。

常用的为Sepharose 2B、4B、6B，因为Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，而吸附容量比Sepharose 2B大，所以Sepharose 4B应用最广。

Sepharose CL：与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，即生成CL型交联琼脂糖，其热稳定性和化学稳定性均有所提高。特别适合含有机溶剂的分离，能承受较强的在位清洗。

FF系列可以耐受较高的流速，轻松实现规模扩大的分离纯化，在短时间内得到较好的分辨率。